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实验小鼠血浆取材要求

　　---必须在采血时或采血后立即与剂充分混合。采血时与抗凝剂混合方法：用于---收集的无菌1ml可以将1ml剂从小瓶吸入，然后将全部剂重新注回小瓶，即在采血前用剂“灌注”采血的。采血后与抗凝剂混合方法：向1.5ml离心管中加入不超过150μl的抗凝剂。在相对离心力14000g下离心血样10-15分。用移液管吸取分离的血浆，并转移到干净的离心管中。可将血浆样本在14000g下再离心2-3分钟，以分离任何剩余的红细胞。将分离好的血浆转移到干净的离心管中。

肺缺血再灌注损伤是由于机体组织或在缺血再灌注后导致肺组织迅速损伤。缺血再灌注可能发生在肺，也可能是下肢或腹主动脉等，导致肺泡上皮细胞和肺毛细胞血管内皮细胞受损。

究其原因可能与组织细胞---、氧自由基产生和促炎因子释放等病理生理反应有关。

结扎法制备肺缺血再灌注损伤模型常用，因其操作简单、成功率高、实用性强，是研究肺缺血再灌注损伤发病机制和---保护的关键。

制备肺缺血再灌注模型我们选用适龄的sd大鼠，通过结扎手术进行造模。

(1)75% (体积分数)酒精消毒孕鼠,在无菌条件下取出胎鼠,分离并切取脊髓,置于冷的无钙、镁的hbss液的平皿中( 下置冰袋)。

(2)解剖显微镜无菌条件下仔细剥离脊膜及血管。

(3)用弹簧剪将脊髓剪成1cm3大小，---液37℃---15-20min，每五分钟振荡一次；

(4)去掉上清，加入终止液终止---，吹打10-15次，不能有气泡，收集上清，剩余组织再---一次。

(5)4℃1000rpm离心10min，弃上清，加入种植液1重悬，培养箱内差速贴壁30min；

(6)收集上清，台盼蓝染色计数，按6*105cells/孔种入六孔板种植液1，37℃，5%co2，95%饱和湿度的培养箱中培养；

(7)培养第二天，全换液更换为种植液2；

(8)培养第四天，半量换液加入5um的，24h全量换液；

(9)之后每周换液两次。

　原位杂---及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶dna变性dna原位杂交，探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针显色检测。

　　玻片的准备和样品固定

　　对于染色体涂片，1：1的---/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。

　　样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为---杂交的功能分子基团被-包裹在dna双螺旋结构中，而交联剂的使用对rna基本没有影响。对于染色体涂片，常使用/固定；石蜡包埋的组织切片用固定。冷冻切片可通过在4%的---中固定30min，或使用bouin固定剂。