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分子实验介绍——荧光定量pcr检测

荧光定量pcr是检测生物样品中rna含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特---的探针，对pcr产物进行标记---，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。cmrna相对表达量变化从图中可以扩增曲线可以看出目的rna扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特---情况，通过使用δδct方法计算可以得到每个组中目的mrna表达变化。目前主要使用sybr green和taqman法对rna含量进行检测。sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。

sybr green i是一种只与dna双链结合的荧光染料。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。我们知道生物体本身的转录过程是一个动态变化且十分复杂的分子作用网络，如果只是对某个单一rna分子的研究，有时并不能准确的发现分子作用机制。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分子的数量。sybr green荧光染料-量pcr的基本过程是：1、开始反应，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。2、dna变性时，sybr green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成pcr产物。4、聚合完成后，sybr green染料与双链产物结合，定量pcr系统检测到荧光的净增量加大。

实验流程：细胞或组织rna提取-rna浓度检测-rna逆转录-定量pcr检测。

结果示例：

图 a 基因扩增曲线图；b 基因扩增溶解曲线图；c mrna相对表达量变化

从图中可以扩增曲线可以看出目的rna扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特---情况，通过使用δδct方法计算可以得到每个组中目的mrna表达变化。

慢---包装

1、细胞准备：细胞传到后，密度达到70％左右时进行转染；

2、细胞转染:取两个ep管，一个加入opti-mem、质粒和包装质粒；另一个加入opti-mem、lipo2000，然后将两管混匀；

3、细胞孵育：将混合液逐滴加入细胞培养皿中，混匀后孵育；

4、收集---：转染后48h、72h收集含慢---的上清；

5、滴度检测:细胞为30%－50％时加入---上清液，检测阳性细胞比例。

分子生物学检测

分子生物学作为现代生物技术中zui为---的实验手段之一，已经广泛渗透到生命科学的各个领域，在基础研究、医l疗诊断等领域均起到了非常重要的作用。

     借助的技术优势，英瀚斯生物特配备了高l效的仪器设备，如slan 48p 荧光定量pcr检测系统、pcr仪、电泳仪、冷冻离心机、高速离心机等。针对预测的靶蛋白结合rna的序列设计引物，做qpcr实验，验证预测的rna是否与靶蛋白有结合，或者将分离出来的rna做高通量测序，筛选到可能与靶蛋白结合的rna。目前公司可为您提供反转录pcr、荧光定量pcr、凝胶电泳迁移率等检测服务，---缩短您的实验周期、降低您的实验成本。