DNA型恒温扩增试剂盒即时留言 立博泰业公司
尿dna糖基化酶尿dna糖基化酶(udg酶)又称尿-n-糖基化酶(ung酶),可水解含尿的单链和双链dna释放出游离尿,而对rna无活性,与dutp搭配使用,可建立成pcr防污染体系。其原理如下:在pcr体系---dttp部分或全部替换为dutp后,使得反应生成含有du碱基的扩增产物,这些扩增产物不同于天然模板,在进入含有udg酶的反应体系时,可被udg酶识别并切割尿碱基与糖磷酸骨架间的n-糖基键,而经切割后的dna链在碱性或高温条件下易于断裂降解,从而失去被当作模板再扩增的能力,因此可防止扩增子污染如下图。市面上的udg酶主要有普通型和热敏型,其中热敏型udg酶在室温条件下即可催化反应,50℃以上加热可使其灭活,防止其降解后续pcr形成的含du扩增产物。虽然udg/dutp体系具有防污染功能,但在实际测试中还得---pcr的效率和灵敏度。一方面需---pcr扩增产物掺入足够量的尿碱基,从而可被udg有效切割;另一方面也需要---反应体系添加的dutp不会明显影响pcr效率,因此dttp和dutp的佳比例需通过优化确定。
逆转录酶逆转录酶又称反转录酶,是一种rna介导的dna聚合酶,其反应过程中体现出三种功能为:以rna作为模板合成互补dna链 (complementary dna, cdna),形成rna:cdna杂交链;发挥rnase h活性,降解rna:dna杂交链中的rna模板;以cdna作为模板合成第二链dna,形成双链dna如下图。其中,rnaseh活性是逆转录酶的一个内在特性,可在合成过程中同时切割rna:cdna杂合链中的rna模板,该特性可能降低逆转录效率,因此在实际应用中,常采用人工改造后的低或无rnase h活性的逆转录酶。常用的逆转录酶有amv和m-mlv,amv分离自禽类成髓细胞瘤---(avian myeloblastosis virus, amv),m-mlv逆转录酶分离自莫洛尼氏鼠---(moloney murine leukemia virus, mmlv),前者热稳定性优于后者,但amv逆转录酶的rnaseh活性也---,不利于长片段cdna合成。市面上多使用经基因工程改造过的m-mlv逆转录酶,其热稳定性改进,可在50℃左右工作,同时rnase h活性进一步减弱,提高了其逆转录效率。
恒温扩增的方法多种多样,其对应的酶体系也各有差别,且一般为多酶体系,在酶原料选择上相比pcr复杂,下面只列举一些主要的恒温扩增方法相关酶。
lamp相关酶环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, lamp)所用酶主要为具有链置换功能的dna聚合酶,详细原理可参考聊聊恒温扩增技术。常用酶为bst dna聚合酶,用于dna链合成,同时具有链置换功能;若检测模板为rna,则可加入逆转录酶配制成rt-lamp反应体系。
提前30分钟将试剂盒所需组分取出,室温融化。鹿荡混匀。
1).每个干粉反应管加入29.4 ul abuffer (注意: abuffer需完全融化混匀,否则会对实验效果产“生影响) ; 1.每个干粉反应管加入29.4 ula
2.每个反应管分别加入2 ul上游引物、2 ul下游引物和0.6 μ探针(引物和探针浓度为10 μm ,对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装
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