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　原位杂---及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶dna变性dna原位杂交，探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针显色检测。

　　玻片的准备和样品固定

　　对于染色体涂片，1：1的---/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。

　　样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为---杂交的功能分子基团被-包裹在dna双螺旋结构中，而交联剂的使用对rna基本没有影响。对于染色体涂片，常使用/固定；石蜡包埋的组织切片用固定。冷冻切片可通过在4%的---中固定30min，或使用bouin固定剂。

样品预处理

　　在待测样品中，dna或rna通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶---暴露：

　　内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的pod可通过含1%h2o2的---处理30min。如果检测酶为ap，可在底物溶液中加入左旋咪唑，ap检测的内源性背景一般来说比pod检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性ap酶的活性基本都丧失了。

　　rnase处理：在dna-dna杂交实验中，rnase的处理可去除内源性rna，增加实验的信噪比。在进行mrna为靶标的检测时，rnase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将dnase-free的rnase溶解于2×ssc(100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。

原位杂交过程

　　杂交前可进行预杂交，以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同，只是预杂交液中不含探针和---葡聚糖。

　　靶dna的变性对mrna的原位杂交无需此步

　　样品dna的变性在dna-dna杂交检测中是必须的步骤，但同时可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性，实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得佳条件。

　　如使用热变性方法，可在杂交时将探针的变性和样品dna变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性，染色体dna样品处理2min，后冷却至37℃进行杂交。组织样品dna的变性时间可增加至80℃10min。

1、致模因素对动物模型的影响

应明确研究目的，清楚相应人类---的发生、------和发病机制，熟悉致病因素对动物所产生的------和发病情况，致病因素的剂量。

2、动物因素对动物模型的影响  

品种、品系、年龄体重、性别、生理状态等

3、实验技术因素对动物模型的影响

实验季节、昼夜过程、---、手术技巧、实验给药、对照组的影响等。

4、环境因素和营养因素对动物模型的影响

模型的成败往往与环境的改变有密切关系。拥挤、饮食改变、过度光照、噪音、屏障系统的破坏等，任何一项被忽视都可能给模型动物带来---影响。