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基因组甲l基化水平(methyl ati on content)的分析:

1.高l效液相色谱(hi gh-performanceli qui dchromatography, hplc)hplc是- -种比较传统的方法,是根据dna或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增l高。将pcr产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为bsp-ke隆测序法。故而能够定量测定基因组整体水平dna甲l基化水平。该方法由ruo等1980年首l次---。过程是将dna样品先经---或氢l氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5 mc/(5mc+5c)的积分面积就得到基因组整体的甲l基化水平。这是一种检测dna甲l基化水平的标准方法。

2.高l效毛细管电泳法(hi gh-per formance capillary electrophoresis, hpce)这是一-种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。基于第二代测序技术的mirna测序，可以一次获得数百万条mirna序列，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同---状态下已知和未知的mirna及其表达差异，为研究mirna对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。用hipce方法处理dna水解产物来确定5mc水平，简便，经济且敏感性高。

蛋白质双向电泳实验流程

1.---yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.双向电泳分离待测样品

(1)一相等电---前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml,否则会造成蛋白质的---或沉淀。

(2)等电---完毕后(约需24hr，若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。

(3)等电---好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%sds-page凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5w/胶 45min，15w/胶 5-8hr，20℃。

3.银染法对凝胶进行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗

3.凝胶扫描及图像分析

(1)图像扫描：凝胶染色后采用image scanner以300dpi，16-bit模式65536灰阶进行扫描。

(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用imagemaster 2d platinum software软件进行分析。在测定时，受检标本(测定其中的抗ti或抗原)与固相载体表面的抗原或抗ti起反应，洗涤使固相载体上形成的抗原抗ti复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗ti，通过反应使其结合在固相载体上。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以zui小点面积30，平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。

蛋白质质谱鉴定服务

蛋白质protein是有机大分子，是构成细胞的基本有机物和生命活动的主要承担者。蛋白质在催化生命体内各种反应进行、---、抵御外来物质入l侵及控制遗传信息等方面都起着重要的作用。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度-于溶解，缩短提取时间。蛋白质的一级结构是---酸序列，通过鉴定---酸序列来匹配它的蛋白质，这是定性研究，是蛋白质组学的基础，也是蛋白质组学的重要技术之一。

质谱一般由离子源、分析器mass ---yzer和离子检测器detector三部分组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)和电喷雾电离质谱(esi-ms)等，质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的途径。elisa的基础是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶标记。现在蛋白质组学基本研究手段是：以生物质谱技术为，对蛋白质进行-、高通量分离、鉴定和分析。

蛋白质质谱鉴定的基本原理是用蛋白酶将蛋白质---成肽段混合物，经maildi或esi等软电离手段将其离子化，然后通过分析器将具有特定质核比的肽段离子分离开来。据估计,在人类基因组中,大约每千个碱基中有一个snp,无论是比较于度多态性(rflp)分析还是微标记(str),都要广泛得多。通过实际谱图和理论上蛋白质经过蛋白酶---后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行的比对，进行蛋白鉴定。

◆　hplc

如果合成的寡核苷酸应用于，定向诱变或定量的基因探测，那么对其纯度要求较高。脱盐或opc纯化的寡核苷酸可能达不到要求，则hplc纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离---，分析速度快的特点。阴离子交换树脂的hplc通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的hplc与阴离子交换树脂的hplc呈现相似的纯化效率。因为hplc的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用hplc法不能有效纯化长的寡核苷酸大于35-mer)。

◆　page

对于长的寡核苷酸的纯化50-100mer，我们page纯化法，它使用交连的聚---凝胶(电泳)作为纯化基质。单核苷酸多态性(snp)实验snp(singlenucleotidepolymorphisn即单核苷酸多态性,是由于单个核苷酸改变而导致的---序列多态性(polymorphism)。尽管page显示出高的纯化效率＞98%，但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在page之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。