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分子实验介绍——印迹western blot检测

通过sds-page凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体例如纤维素薄膜或pvdf膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。将含有靶基因mrna同源互补序列的rnadoublestrandrna，dsrna导入细胞后，能够特异地识别该mrna，引起mrna的降解，从而导致相应的功能缺失。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的起反应，再与酶或同位素标记的第二起反应目前主要用hrp标记的第二，经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特---目的基因表达的蛋白成分目前主要使用鲁米诺和二-的hrp反应发出荧光，通过仪器或者胶片显色。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验流程：细胞收集-细胞裂解，蛋白提取-蛋白变性-sds-page电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照

结果示例：

图 a不同大小的质粒转染细胞后，western blot检测图片；b a蛋白不同培养时间后western blot检测图片；c 使用image pro plus软件对a蛋白灰度检测，a蛋白表达变化统计图

慢---包装

1、细胞准备：细胞传到后，密度达到70％左右时进行转染；

2、细胞转染:取两个ep管，一个加入opti-mem、质粒和包装质粒；另一个加入opti-mem、lipo2000，然后将两管混匀；

3、细胞孵育：将混合液逐滴加入细胞培养皿中，混匀后孵育；

4、收集---：转染后48h、72h收集含慢---的上清；

5、滴度检测:细胞为30%－50％时加入---上清液，检测阳性细胞比例。

染色质免l疫共沉淀技术(chip)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, chip)技术可以真实、完整地反映结合在dna序列上的调控蛋白。由于chip采用甲醛固定活l细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内tf与promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。这些方法究竟孰优孰劣，斯坦福大学医学院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌l症、心血l管病以及中央神经系统紊乱等---主要通路的一-种非常有效的工具。

染色质免l疫沉淀分析(chip) 的基本原理是在活l细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与---(dna或rna)之间会产生共价键。细胞内，当f与promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。当检测如转录调控因子一类的dna结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。固定的蛋白质dna复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特---识别反应沉淀此复合体，特---地富集目的蛋白结合的dnal片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与dna相互作用的信息。通过qpcr或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知dna信息。

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。

一、主要方法

1. 蛋白质的选择吸附分离利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到。

2. 按照配体特性的分离-亲和层析利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质。

3. 低温沉淀法，使用如，---等与水可混溶的，降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出，和盐析相比较，这种方法的分辨率的高，然而蛋白质比较容易变形，需要在低温下进行。

4. 按照分子大小不一样的方法，密度梯度离心在介质中对蛋白质离心时，蛋白质沉降速度取决于它的和密度，和密度越大，那么沉降越快；凝胶过滤一种柱层析；超过滤利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质。

5. 按照溶解度差异分离，等电点沉淀法盐溶与盐析使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小；因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为 0，使分子间静电斥力减少了，所以，---沉淀比较容易，这时具有小的溶解度。

6. 按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。