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线粒体测序

线粒体是真核生物的重要细胞器，是生物体的能量工厂，参与能量代谢、信号转导、细胞凋亡等许多生命活动，对生物的生理活动起着-的作用。大部分线粒体基因由于其母系遗传特性以及进化速率较快等特点，被广泛地用于种群遗传学、进化生物学、谱系地理学和系统发育学、-诊断等学科领域。线粒体全基因组在生物进化的研究中具有的优势。由于线粒体有着与真核生物长期共生的进化历史，因此其基因组包含了反映物种进化的关键信息，同时，相对于核基因组，线粒体基因组小，容易对大量物种进行横向的比较分析，有利于生物进化的研究，因而受到进化生物学家的-。高通量的蛋白质组学研究技术可以在上述过程中筛选出具有潜在价值的生物标记和靶点。线粒体的组成可以从两个层面上反映物种及群体的遗传和进化，即-序列组成和基因组的结构特征，两者的特征具有不同的进化机制和进化速度，在进化生物学研究中可以-的互补。

蛋白提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液, 少数与脂类结合的蛋白质则溶于-、-等有ji溶剂中，因些，可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度-于溶 解，缩短提取时间。但另一方面. ,温度升高会使蛋白质变性失活,因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。12000r/min于4c离心5min,小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10~15min。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi--,碘yi酸等)。

rna pull down 检测

rna   pull down：rna沉淀检测，是检测rna结合蛋白与其靶rna之间相互作用的主要实验方法之一。使用体外转录将rna进行生物素标记，并与细胞蛋白裂解液孵育，形成rna-蛋白复合物。复合物通过磁珠结合后分离，复合物纯化洗脱后通过western blot验证检测特性的蛋白。若筛选可能结合的蛋白通过质谱实验进行检测筛选。不过该-构建时会进行片段化选择从而滤掉了smallrna的信息，所以需要另外再构建一个smallrna-，进行测序分析后可以得到mirna和其他smallrna的鉴定及注释信息。

二、使用说明

1、装载探针

对于-时间较短通常为2小时以内的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的-细胞。对于细胞-

时间较长通常为6小时以上的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的-细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1：1000用无培养液稀释dcfh-da，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的dcfh-da。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的dcfh-da的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。通过识别个体基因组在特定位点的特定序列重复，即可创建其基因档案。用无细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。