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分子实验介绍——荧光检测

细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原定位的技术。在细胞中，通过特定的标记，可以检测目的蛋白表达量和表达定位。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白定位和表达的实验方法。

实验流程：细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-dapi染色-荧光显微镜拍照或激光共---显微镜拍照。

结果示例：

细胞荧光染

通过观察细胞中蛋白的荧光强度和定位分析该蛋白的表达变化。

microrna芯片:

rna干扰(rna interference, rnai)现象是一种进化上保守的抵御或外来---qin犯的防御机制。将含有靶基因mrna同源互补序列的rnadouble strand rna， dsrna导入细胞后，能够特异地识别该mrna，引起mrna的降解，从而导致相应的功能缺失。rnai提供了一种经济、快捷、gao效的抑制特异基因表达的技术手段,该技术已被广泛用于研究基因功能和chuan染性---及恶xingzhong瘤基因zhi疗领域。报告:根据证实为大肠阳性的管数，查mpn表，报告每100ml(g)大肠菌群的mpn值。目前常用的rna干扰手段为mirna、 shrna和sirna等。

mirna是一类可以通过rnai机制调节基因表达的内源性小rna，人工mirna与shrna的设计原理基本相同，由于mirna具有内源性，因此其更易产生有效的基因沉默。

技术流程：

dsrna或pre-mirna被导入细胞后，能够被一种特异的---内切酶dicer识别并切割成为小片段，这些片段在rna解旋酶的作用下解链。继之反义链在与体内一些酶包括内切酶、外切酶、解旋酶等结合形成rna---的沉默复合物rna-induced silencing complex，risc，risc与mrna同源区进行特---结合，若mirna与mrna的结合位点配对，则切割mrna；在逆转录---载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了和包装信号，通过分子技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供---载体包装成---粒子所需的结构蛋白。若mirna与mrna的结合位点不配对，则抑制mrna的翻译。

rna酶rnase是导致rna降解主要的物质。此酶非常稳定，在一些的条件下只可暂时失活，但---因素去除后又迅速恢---性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的rnase完全失活。

1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备rna时必须戴手套

2.rnase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以depc配制的70%---擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。

3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理

1塑料制品：尽量使用---无菌塑料制品。已标明rnase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。

单细胞rna测序

单细胞rna测序也称scrna-seq。通常而言，一般的组织细胞rna-seq实验会产生1000万个读数，如果一个基因的频率超过50rpkm，即每百万读数中每千个碱基中超过50个，这一基因即被认为有表达。泊松分布下，1kb长的基因有超过500个读数和4%的小变异系数，即cv值；rnai提供了一种经济、快捷、gao效的抑制特异基因表达的技术手段,该技术已被广泛用于研究基因功能和chuan染性---及恶xingzhong瘤基因zhi疗领域。哺乳动物细胞通产含有200,000个mrna，因此至少要用50个单细胞一起才能到达小cv值；考虑到逆转录的效率和环境干扰等因素，为得到准确的表达和细胞种类的识别，需要使用的细胞数量实际要更多。