天津PCR实验室服务为先 英瀚斯生物科技公司

单细胞rna测序

单细胞rna测序也称scrna-seq。通常而言，一般的组织细胞rna-seq实验会产生1000万个读数，如果一个基因的频率超过50rpkm，即每百万读数中每千个碱基中超过50个，这一基因即被认为有表达。泊松分布下，1kb长的基因有超过500个读数和4%的小变异系数，即cv值；哺乳动物细胞通产含有200,000个mrna，因此至少要用50个单细胞一起才能到达小cv值；离心后吸上清液400u1移入相应编号的ep管中，再加入400ul异充分混匀。考虑到逆转录的效率和环境干扰等因素，为得到准确的表达和细胞种类的识别，需要使用的细胞数量实际要更多。

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。

一、主要方法

1. 蛋白质的选择吸附分离利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到。

2. 按照配体特性的分离-亲和层析利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质。

3. 低温沉淀法，使用如，---等与水可混溶的，降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出，和盐析相比较，这种方法的分辨率的高，然而蛋白质比较容易变形，需要在低温下进行。

4. 按照分子大小不一样的方法，密度梯度离心在介质中对蛋白质离心时，蛋白质沉降速度取决于它的和密度，和密度越大，那么沉降越快；凝胶过滤一种柱层析；超过滤利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质。

5. 按照溶解度差异分离，等电点沉淀法盐溶与盐析使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小；因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为 0，使分子间静电斥力减少了，所以，---沉淀比较容易，这时具有小的溶解度。

6. 按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。

◆　hplc

如果合成的寡核苷酸应用于，定向诱变或定量的基因探测，那么对其纯度要求较高。脱盐或opc纯化的寡核苷酸可能达不到要求，则hplc纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的hplc通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的hplc与阴离子交换树脂的hplc呈现相似的纯化效率。因为hplc的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用hplc法不能有效纯化长的寡核苷酸大于35-mer)。平台成熟---：采用agilent原位喷墨合成技术，了高检测灵敏度和特---。

◆　page

对于长的寡核苷酸的纯化50-100mer，我们page纯化法，它使用交连的聚---凝胶(电泳)作为纯化基质。尽管page显示出高的纯化效率＞98%，但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在page之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。用预先固化在beads上的蛋白质a的抗ti免yi沉淀a蛋白，那么与a蛋白在体内结合的蛋白质b也能一起沉淀下来，再通过蛋白变性分离，对b蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。

11.如何溶解引物？

答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mm tris ph7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的ph值比较低ph4-5,引物在这种条件下不稳定。(1)加入12μ1的tsr于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解dna沉淀，稍离心。

12.如何保存引物？

答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的od数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。