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原位杂交技术基本原理

原位杂交技术的基本原理是利用-分子单链之间有互补的碱基序列，将有放6射性或非放6射性的外源-(即探针)与组织、细胞或染色体上待测dna或rna互补配对，结合成专一的-杂交分子，经一定的检测手段将待测-在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。

为显示特定的-序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。

多种探针标记检测系统

基于地高3辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。

荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dutp/utp/ddutp上连接fluorescein后进行-标记。由于标记在-上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。

杂交技术zui重要的因素之一是选择zui适的杂交反应温度。若反应温度低于tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低tm-30℃，虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或-些的dna，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即zui适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。

zui适复性温度optimunm renaturation temperature, tor：tor =tm –25℃

苛刻复性温度：ts = tm – (10或15℃)

非苛刻复性温度：tns =tm – (30或35℃)