陕西细胞融合实验报告动物实验模型 南京英瀚斯生物科技

细胞实验介绍——慢-建立稳转细胞系

慢-包装：公司使用3质粒慢-包装系统，慢-系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，过表达慢-系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢-颗粒纯化试剂盒将慢-纯化。纯化后留取部分检测-滴度，其余-冻存于-80℃冰箱中。一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-pi染色-流式细胞仪检测。

滴度检测：将-颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算-滴度。

细胞：在-前-对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释-，加入12孔板中对细胞进行，-数量根据细胞的moi加入若无moi，需做-梯度：1,5,10,50,100 5个梯度对细胞，6h后去除含-溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的基因的稳定表达情况。破骨细胞标志基因trap在共培养3天时开始表达，而mmp-9和cathepsink则在共培养5天后表达结论共培养体系中成骨细胞对破骨细胞调控作用--的破骨细胞具有噬骨能力，该共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究。

实验流程：慢-质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞--收集--纯化--滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 a -滴度检测；b 目的细胞-效果图

透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边.集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和调亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

结果评判:调亡细胞体积变小，细胞质浓缩。(5)把-所得的软gu细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数,并把细胞混悬液密度调整为2x105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。调亡i期( pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色-度盘绕，出现许多称为气穴现象( cavitati)的空泡结构; iia 期细胞核的染色-度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生调亡小体。

目的

学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达绿色荧光蛋白，为染色准备实验材料。

实验原理

上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。

外源基因进入细胞主要有四种方法：法、磷酸钙法和脂质体介导法和-介导法。法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；-法是利用包装了外源基因的-细胞的方法使得其进入细胞。但是由于法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；-法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，收集上清。

利用脂质体转染法重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有-的作用。

细胞冻存有哪些注意事项？

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分-。平板克l隆形成实验基本步骤::1、取对数生长期的各组细胞，分别用0。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。

细胞冻存的步骤：

配制含 10%dmso 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;

取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 pbs 清洗。

去除 pbs，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞-下来;

离心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;

将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;

冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。6%低熔点琼脂糖与2x细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。