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就dna探针和rna探针的比较，dna探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而rna 探针的应用，将提高dna-rna杂交子的热稳定性。

tips：rna探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特-和灵敏度均优于dna探针。常用的rna探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过pcr扩增的方法，可以更方便地进行rna探针的制备；rna探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特-。

使用分支dna信号扩增的rna fish

invitrogen? viewrna?和primeflow?检测是使用分支dna信号扩增 (bdna) 来检测特-信号的直接荧光rna ish方法。 使用独立但兼容的信号扩增系统让rna靶标的多重复用成为可能。 荧光rna原位杂交检测分为四个主要步骤：样本制备、靶标杂交、信号扩增以及检测。 该方法可实现更高的特-，-的背景值和更高的信噪比。

杂交技术zui重要的因素之一是选择zui适的杂交反应温度。若反应温度低于tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低tm-30℃，虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或-些的dna，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即zui适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。

zui适复性温度optimunm renaturation temperature, tor：tor =tm –25℃

苛刻复性温度：ts = tm – (10或15℃)

非苛刻复性温度：tns =tm – (30或35℃)