-共沉剂来电咨询「在线咨询」

随着基因组测序、分子生物学检测手段的快速发展，pcr和荧光定量pcr实验，正在越来越多的实验室应用。然而，pcr作为一种高灵敏度的检测手段，pcr的实验结果也容易被各种无关的外源性dna或rna所干扰。

pcr实验室中，很容易发生dna的交叉污染，污染通常来自于离心管、移液器和其他试验设备产生的dna气溶胶，或dna溶液污染桌面，或吸样枪不慎将样品或模板-吸入枪内。据估算，一个气溶胶颗粒可含48000个dna拷贝。 因此，为---pcr试验的数据准确，避免交叉污染，应定期对pcr实验室做dna污染情况的监测。

从动物组织中提取基因组dna

使用研钵进行匀浆时：

取1～100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的研钵中，快速用力展研成匀浆。注下列组织请加液氮研磨至粉末状。

a．富含dna酶的胰脏、脾1脏、胸腺、淋巴等组织。

b．富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。

c．富含角质蛋白的组织或坚硬的组织如骨骼等。

加入650 μl的solution a和0.9 μl的rnase a1，温和研磨30秒钟。注使用上述-注的实验材料时，请在加入solution a及rnase a1后，将研钵置于65℃水浴上研磨1分钟。

收集650 μl研磨好的组织匀浆液移至collection tube中。如果匀浆体积不足650 μl，请补充solution a至650 μl，65℃保温5分钟。

使用研磨棒进行匀浆时:

取1～100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的collection tube 中，用研磨棒快速研磨成糊状。

加入350 μl的solution a和0.9 μl的rnase a1后用研磨棒快速研磨成匀浆。

加入350 μl的solution a将研磨棒上的匀浆冲入collection tube中，充分振荡混合后，65℃保温5分钟。

如何确认rna的

实时荧光定量pcr技术是通过测定rna的转录水平来评估基因的活力。rna样本提取的直接影响基因表达分析。影响rna品质的因素有以下三种：rna浓度、rna纯度和rna完整性。

检测rna浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种：

紫外分光光度计法：

测量260nm吸收值计算rna浓度，测量260nm/280nm吸收值的比值，用于评估rna纯度。需要注意的是：在检测-物质时应该在固定的ph溶液中进行。

260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1 之间。＜1.9，说明有蛋白质残留；＞2.1，说明rna可能发生降解。

琼脂糖凝胶电泳：

完整的rna通常有三条带，zui亮的是28s条带，其次是18s条带，zui淡的是5s条带部分试剂盒提取时会过滤掉5s条带。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28s和18s的比值。该方法主要用于检测rna的纯度和完整性。

如果28s和18s条带明亮、清晰、条带锐利，28s的亮度在18s条带的两倍以上，我们认为rna的zui好。

若rna条带出现弥散，原因可能：rna被-酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。

为什么用无水---沉淀dna

　　用无水---沉淀dna，这是实验中较常用的沉淀dna的方法。---的优点是可以任意比和水相混溶， ---与-不会起任何化学反应，对dna很安全，因此是理想的沉淀剂。

　　dna溶液是dna以水合状态稳定存在，当加入---时，---会夺去dna周围的水分子，使dna失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水---与dna相混合，其---的zui终含量占67%左右。 因而也可改用95%---来替代无水---(因为无水---的价格远远比95%---昂贵)。

　　但是加95%的---使总体积增大，而dna在溶液中有一定程度的溶解，因而dna损失也增大， 尤其用多次---沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀dna时可用95%---代替无水乙酵， 后面的沉淀步骤要使用无水---。也可以用0.6倍体积的---1醇选择性沉淀dna。一般在室温下放置15-30分钟即可。