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分子实验介绍——荧光检测

细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原定位的技术。在细胞中，通过特定的标记，可以检测目的蛋白表达量和表达定位。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白定位和表达的实验方法。

实验流程：细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-dapi染色-荧光显微镜拍照或激光共-显微镜拍照。

结果示例：

细胞荧光染

通过观察细胞中蛋白的荧光强度和定位分析该蛋白的表达变化。

染色质免l疫共沉淀技术(chip)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, chip)技术可以真实、完整地反映结合在dna序列上的调控蛋白。由于chip采用甲醛固定活l细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内tf与promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。mirna在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌l症、心血l管病以及中央神经系统紊乱等---主要通路的一-种非常有效的工具。

染色质免l疫沉淀分析(chip) 的基本原理是在活l细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与-(dna或rna)之间会产生共价键。细胞内，当f与promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。当重组---载体导入包装细胞后，缺陷---载体和包装细胞的互补作用共同完成---装配，该---颗粒可其它宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。固定的蛋白质dna复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特---识别反应沉淀此复合体，特---地富集目的蛋白结合的dnal片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与dna相互作用的信息。通过qpcr或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知dna信息。

3、参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测---前后荧光的强弱。dcf的荧光光谱和fitc非常相似，可以用fitc的参数设置检测dcf。dcf的激发光谱和发射光谱参考下图。

4、其它说明

阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照---。通常---后20-30分钟内可以观察到非常---的活性氧水平升高。这些方法究竟孰优孰劣，斯坦福大学医学院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在---后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

另外，对于某些细胞，如果发现没有---的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释dcfh-da，使装载探针时dcfh-da的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。

二、操作步骤：

1. 所有在纯化系统里使用的溶液当日都需要经过 0.22μm 的滤膜抽滤、脱气处理；保存 4℃ 冰箱里的缓冲液若要在室温使用需恢复至室温后抽滤脱气；

2. 样品上柱纯化前，需先滤膜过滤，少量样品可用离心13000rpm，10min；

3. 依次用水、缓冲液洗泵；设置流速和柱前警报压压力值参阅层析柱及填料说明书，取较小的一个大耐受压力。防止柱中进入气泡，影响分离效果；

4. 当柱子限压在 0.3mpa，或者在限压状态---速很低时，ph valve 中的 restirtor 可以切换成 off line，即显示 by-pass 状态；

5. 当需要通过仪器上样环上样时，将 w1 阀口处换成带透明短软管的阀门，从此处阀门位通过倒吸样品上样；

6. 进样阀「inject」为上样状态。上样结束可将进样阀切换回「load」状态。并用纯水认真清洗上样环至少 3 次；将 w1 阀口处换回原来接头阀门。

7. 纯化结束后，用纯水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的---清洗泵以及系统。长期不用，层析柱应保存在 20% 的---中，泵放置在 20% ---中；

8. 实验结束后及时倾倒废液瓶里的废液；