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转录组重测序      

      转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mrna的总和。从单个的生物体到qi官到组织到细胞，再从细胞结构到---和蛋白的分子水平，人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构如---序列，来横向比较不同物种，同物种不同个体，同个体不同细胞或不同生理病理状态的差异。转录组研究是基因功能及基因结构等研究的基础，通过新一代高通量测序，能够快速的获得某一物种特定组织或在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于---诊断、基础研究和研发等领域。

     转录组resequencing针对的是有参考基因组的物种。用新一代高通量测序技术对某物种的特定组织或细胞进行转录组测序，与参考基因组比较，可以得到基因表达差异、可变剪接、融合基因等遗传调控信息。

1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚---胺三酯法。dna合成仪有很多种, 主要都是由abi/pe 公司生产，而bioneer自行研制的384并行高通量dna合成仪，可实现99%的高合成率。针对预测的靶蛋白结合rna的序列设计引物，做qpcr实验，验证预测的rna是否与靶蛋白有结合，或者将分离出来的rna做高通量测序，筛选到可能与靶蛋白结合的rna。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚---胺三酯法合成dna，具有、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚---胺三酯法是将dna固定在固相载体上完成dna链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′***5′磷酸二酯键连接。

步是将预先连接在固相载体cpg上的活性基团被保护的核苷酸与---反应，脱去其5′----的保护基团dmt，获得游离的5′----。

第二步，合成dna的原料，亚---胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′----仍然被dmt保护，与溶液中游离的5′----发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有数5′----没有参加反应(少于2%)，用酐和1-咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚---形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以---脱去它的5′----上的保护基团dmt，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察tca处理阶段的颜色判定合---率。

通过---高温处理，连接在cpg上的引物被切下来，通过opc,和page等手段纯化引物，成品引物用c18浓缩、脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定od260定量，根据定单要求分装。

13.合成的引物5端是否有磷酸化

答：合成的引物5为---，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。

14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？

连接反应需要引物的5磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。技术流程：dsrna或pre-mirna被导入细胞后，能够被一种特异的---内切酶dicer识别并切割成为小片段，这些片段在rna解旋酶的作用下解链。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要---引物退火的条件。sirna分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。

20.primer设计的基本原则是什么？

答：引物设计的下列原则供您参考。

◆引物长度一般在18-35mer。

◆g-c含量控制在40-60%左右。

◆避免近3端有酶切位点或发夹结构。

◆如果可能避免在3端5个碱基有2个以上的g或c。

◆如果可能避免在3端1个碱基为a。

◆避免连续相同碱基的出现，---是要避免gggg或更多g出现。

◆退火温度tm控制在 58-60c 左右。

◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

21.为什么引物的od260/od280小于1.5 ？

答：引物应该全是dna，但是od260/od280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要---的是od260/od280的比值不能用来衡量引物的纯度。od260/od280的比值过低一般是由于引物中c/t 的含量比较高所致。化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中常用的是十八烷基硅l烷(又称ods)键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。下表是一个20mer 同聚体引物的od260/od280的比值，清楚表明od260/od280的比值与引物的碱基组成密切相关。